本研究利用BCPDA進行固相TRF IA研究,它克服了解離增強體系需增強溶液、易受環境銪離子污染、只能液相測量等缺點,簡化了測量步驟。結合BCPDA標記BSA,研究標記過程中的蛋白質含量測定。為TRF IA體系提供理論依據和實驗技術 。材料和方法

　　1　材料

　　1. 1　儀器　分光光度計,核酸蛋白檢測儀, 磁力攪拌器, pH22酸度計, 層析柱，凱氏定氮儀，半自動定氮儀 。

　　2. 2 　試劑　BCPDA (自合成) , 99. 999%Eu2 03 (自制) ,牛血清白蛋白, SephadexG250葡聚糖, 三羥甲基胺基甲烷(超級純) ,考馬斯亮藍G2250  ,無水碳酸鈉和無水碳酸氫鈉等試劑均為市售分析純以上。相關緩沖溶液均自制。實驗用水:去離子水。

　　2　方法

　　2. 1　標記反應　室溫下,蛋白質在0. 1mol/LpH = 9. 1的碳酸鹽緩沖液中衍生后,用二甲基甲酰胺(DMF)溶液將最新制備的BCPDA溶解,分幾份以1min間隔加入,同時連續渦流旋轉蛋白質溶液,室溫攪拌30min反應結束。

　　2. 2 　分離純化　標記反應液中除有一部分BCPDA與蛋白質結合外,還存在游離狀態的BCP2DA,將標記反應液通過凝膠層析柱,將結合的BCP2DA與游離的BCPDA加以分離,第一峰為結合峰,第二峰為游離BCPDA峰。在核酸蛋白儀280nm監測下,收集結合峰部分的溶液。

　　2. 3　BCPDA標準溶液配制　稱取一定量BCP2DA用DMF溶解,用pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖溶液稀釋成一定濃度,配制成BCPDA標準溶液,備用。

　　2. 4　溶液中BCPDA含量測定　①利用BCPDA在325nm的特征吸收,其消光系數為1. 5 ×10⁴mol/L^-1 ·m^-1 ,計算BCPDA的濃度,公式為: BCPDA濃度(C) =吸光度(A) / (比色皿厚度×消光系數) ×稀釋倍數,本實驗中: C = A / (1cm ×1. 5 ×104mol/L^-1m^-1) ×稀釋倍數; ②將BCPDA標準溶液分別用pH= 9. 1 碳酸鹽緩沖液, pH = 8. 0 NH4HCO3 緩沖液,pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖液稀釋至不同濃度,置1cm ×1cm石英吸收池測其在325 nm處A值,做出工作曲線。同法測定樣品,在對應工作曲線上查出樣品中的BCPDA濃度。

　　2. 5　BSA標準溶液配制　稱取一定量BSA用乙醇溶解,用pH = 9. 1的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成一定濃度,備用。

　　2. 6　考馬斯亮藍染色劑配制　稱取0. 020g考馬斯亮藍G2250溶于95% 10mL 乙醇,加85%磷酸20mL,加去離子水稀釋至200mL 。

　　2. 7　考馬斯亮藍染色法BSA標準溶液配制　取不同體積的BSA標準蛋白溶液, 分別加入10mL 容量瓶,用Tris2HCl緩沖液加到1mL,加染色液定容至刻度,立即搖勻,室溫放置10min,測595nm吸光度。

　　2. 8　考馬斯亮藍染色法BSA—BCPDA溶液配制　從反應瓶中取一定量反應液至5mL 容量瓶,加Tris2HCl緩沖液到1mL,再加入考馬斯亮藍G2250染色液到刻度,室溫放置10分鐘,測595nm吸光度。

結果與討論

　　1　BSA的吸收光譜性質

　　分別用pH = 9. 1 碳酸鹽緩沖液, pH = 8. 0NH4HCO3 緩沖液, pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖液分別將BSA儲備液稀釋至不同濃度,置1cm ×1cm石英池測其在280nm處吸光值。三種緩沖液稀釋BSA吸光值與其濃度(1028 ～1026 mol/L)之間呈良好線性關系。

　　2　BCPDA的結構

從BCPDA 的結構上看,它含有兩個磺酰氯基團,可在溫和條件下與蛋白質的游離氨基共價結合。它含有的異芳香基氮和兩個羧基共同構成了與銪離子螯合的部位。以BCPDA2Eu3 +螯合物標記蛋白質形成了性質十分穩定的熒光螯合物,經紫外光激發能夠產生具有較高量子產率、較大Stokes位移、較窄發射譜帶、較長熒光壽命( 10～1000μs)的熒光。其結構如圖。

　　3　BCPDA的吸收光譜

　　將BCPDA標準溶液分別用pH = 9. 1碳酸鹽緩沖液, pH = 8. 0 NH4HCO3 緩沖液, pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖液稀釋至不同濃度,置1cm ×1cm石英吸收池測其在280、325 nm A 值,三種緩沖液稀釋的BCPDA與其濃度(1026 ～1024 mol/L)之間呈良好線性關系,主要吸收光譜峰為232. 95、291. 58、325. 04nm。

　　4　BCPDA在280 nm處吸收干擾BSA測定

　　蛋白質含量測定在TRFIA標記實驗中涉及到標記比的計算,監測標記反應過程,標記條件控制,因此蛋白含量的測定及其準確性、靈敏性尤為重要。液相TRF IA 體系應用EDTA 等雙功能螯合劑在280nm 處并未干擾蛋白質的特征吸收, 可采用280nm處紫外吸收法測定蛋白質含量。而在新型雙功能螯合劑BCPDA 基礎上建立起來的固相體系,BCPDA與蛋白質均在280nm處有較強吸收,這是因為蛋白質在280nm處的特征吸收緣于水解生成的大量氨基酸及苯環結構,而從BCPDA的分子結構式來看同樣存在苯環結構并含羧基,所以紫外吸收法測定蛋白質含量并不適用固相體系。

　　5　考馬斯亮藍G2250染色法測蛋白質含量對比實驗

　　將同樣濃度BSA標準溶液和BSA2BCPDA 標記反應液用考馬斯亮藍G2250 染色法測蛋白質含量,對比實驗結果如表1。結果表明,在1. 0～8. 0μg/mL濃度范圍內,BCPDA未干擾BSA測定。

實驗也在5. 0～40μg/mL濃度范圍內進行了研究,BSA 與BSA2BCPDA 溶液的A 值具有較好的一致性,符合比爾定律,滿足標記監測要求。

6   層析后的BSA2BCPDA標記液蛋白質含量檢測從所收集的純化反應液中,用考馬斯亮藍法檢測,并與BSA標準溶液的標準曲線對照,查出相應蛋白質含量, 計算回收總量。實驗測定了不同樣品(BCPDA /自由氨基)的BSA2BCPDA中BSA含量,結果如表2。

　7　緩沖溶液選擇

　　實驗比較了用pH = 7. 8 Tris2HCl、pH = 9. 1NH4HCO3、pH = 9. 1碳酸鹽、pH = 8. 0 NH4HCO3 緩沖液作為測定溶劑體系,發現使用pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖溶液的工作曲線線性好于后三者。

　　8　相關樣品參數

實驗測定了用1. 5cm ×25cm 層析柱, 不同(BCPDA /BSA自由氨基) 投料比的標記物標記比(BSA mol/BCPDA mol)和BSA 回收率(% ) (見表3) 。BCPDA 標記BSA 反應最高蛋白質回收率為54. 85%,初步推測標記比隨BCPDA量增加而增大。

　9　BCPDA2BSA2 Eu3 +的螯合反應及熒光光譜

　　將一定濃度的BCPDA2BSA液中加入含有Eu3 +的Tris2HCl緩沖液,按一定倍數稀釋,于37℃恒溫育0. 522h,使BCPDA與Eu3 +發生螯合反應,室溫穩定1h后用337. 1nm 激發,可測得銪離子熒光特征峰589、611nm。

結　　論

　　( 1)紫外吸收法不適合固相TRFIA 體系BSA2BCPDA中蛋白質的測定。

　　(2)實驗研究了在1027 ～1025 mol/L BCPDA標準溶液中加入適量考馬斯亮藍染色液時, 595 nm處未見明顯吸收。

　　(3)用考馬斯亮藍G2250染色法測定BSA2BCPDA中的BSA,在本實驗條件下,工作曲線范圍為0. 50～40. 0μg/mL,曲線回歸方程為: Y =0. 00032 +0. 0015X, r=0. 9996。檢測下限以3σ/ r計算,為0. 35μg/mL ( n =9) , RSD <7. 8% 。該法操作簡便迅速,具有消耗樣品量少,干擾程度小,靈敏性高等優點。　(4)將考馬斯亮藍染色法用于固相TRF IA標記物中蛋白質測定,對多苯環螯合物、配位體與蛋白質連接研究具有一定意義。