4分子標記鑒定法

廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質。蛋白質標記包括種子貯藏蛋白和同工酶(指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式)。狹義的分子標記概念只是指DNA標記，而這個界定現在被廣泛采納。由于DNA分子中堿基的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于長短與排列不一的重復序列等而產生多態性，DNA分子標記便是檢測這種多態性的技術，故DNA分子標記技術又稱作分子診斷技術。分子標記能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。與上述三種鑒定法相比較，分子標記具有許多明顯的優點，表現為：(1)直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否等問題；(2)數量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；(3)多態性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創造；(4)表現為中性，不影響目標性狀的表達；(5)許多標記表現為共顯性的特點，能區別純合體和雜合體，提供完整的遺傳信息。分子標記的這些優點，使它己廣泛用于植物分子圖譜的構建、植物遺傳多樣性分析與種質鑒定、重要農藝性狀基因定位與圖位克隆、轉基因植物鑒定、子標記輔助育種選擇等生命科學的理論和應用研究中。

生物在長期的進化過程中產生了許多由DNA堿基序列變異所致的可遺傳變異。這些DNA堿基序列變異主要有DNA重排、堿基替換、缺失、插入、倒位、易位和序列重復等多種形式。分子標記技術正是以物種內這種存在著極為豐富的DNA堿基序列變異為基礎而開發起來的。

4．1 RFLP (Restr iction fragment length pOlymorphism，限制性片段長度多態性標記）

該技術由Grodzicker等于1974年創立，1980年由Botstein再次提出，并由SOLLER和Botstein(1983)最先應用于品種鑒別和品系純度的測定，這是第一個被應用于遺傳研究的DNA分子標記技術。

RFLP是在分子克隆技術基礎上發展起來的一種遺傳標記。特定生物類型的基因組DNA，經某一種限制性內切酶完全酶解后，會產生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。RFLP標記技術的基本原理，就是通過電泳的方法分離和檢測這些片段。凡是可以引起酶解位點變異的突變，如點突變(新產生和去除酶切位點)和一段DNA的重新組織(如插入和缺失造成酶切位點間的長度發生變化)等，均可導致限制性等位片段的變化，從而產生RFLP多態性。該技術包括以下基本步驟：DNA提取；用DNA限制性內切酶消化；凝膠電泳分離限制性片段；將這些片段按原來的順序和位置轉移到易操作的濾膜上；用放射性同位素或非放射性物質標記的DNA作探針與膜上的DNA雜交(稱Southern雜交)；放射性自顯影或酶學檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態性，即可產生和獲得反映生物個體或群體特異性的RFLP圖譜。RFLP分析中所使用的探針，通常是隨機克隆的與被檢測物具有一定同源性的單拷貝或低拷貝基因組片段或cDNA片段。

RFLP指紋圖譜的優點主要表現在：第一，可靠性較高。因為它由限制性內切酶切割特定位點產生；第二，來源于自然變異。依據DNA上豐富的堿基變異無需任何誘變劑處理；第三，多樣性。通過酶切反應在DNA水平上來反映所有差異，且RFLP標記遍布于整個基因組，故而在數量上幾乎沒有任何限制；第四，共顯性。RFLP標記能夠區別雜合體與純合體；第五，無表型效應。不受發育階段及器官特異性限制。